細胞工学 32巻5号 (2013年4月発行)

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特集　ゲノム編集革命:遺伝子改変はZFN･TALEN･CRISPR/Cas三強時代へ

基礎の基礎山本　卓 32巻5号 , 2013年4月 , pp.506-509

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遺伝子ターゲティングは相同組換え修復（homologydirectedrepair；HDR）を介して標的ゲノム領域に外来の遺伝子を挿入する技術で，酵母やマウスなど限られた生物の遺伝子ノックアウトや遺伝子ノックインに利用されている．相同組換え効率が低い多くの生物では遺伝子ターゲティングを利用することが困難であり，化学物質や放射線，トランスポゾンを突然変異体の作製に利用している．また，遺伝学的な解析の困難な生物においては，モルフォリノアンチセンスオリゴ（MO）やsiRNAを用いた遺伝子ノックダウンによって遺伝子の機能解析を行っている．しかしながら，化学物質や放射線による変異体作製では変異がランダムに誘発されるため，目的の遺伝子に変異が入った個体を選び出すスクリーニングに多大な労力を必要とする．また，MOやsiRNAによる機能阻害は一過的あるいは不完全である場合も多い．これらの状況から，培養細胞から動植物において広く利用可能な標的遺伝子の改変技術の開発が待たれていた．近年，遺伝子のノックアウトやノックインに利用可能な人工の制限酵素（人工ヌクレアーゼ）が開発された．人工ヌクレアーゼを用いることで，これまで遺伝子改変が困難であった培養細胞や動植物においてゲノム編集（標的遺伝子への変異導入や遺伝子ターゲティング）が可能となってきた．本特集では，人工ヌクレアーゼの作製方法から様々な生物での利用例など最近の成果を中心に話題を提供する．

TALENの効率的な作製と動物個体への応用佐久間　哲史 , 鈴木　賢一 , 坂本　尚昭 , 山本　卓 32巻5号 , 2013年4月 , pp.510-514

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TALENは標的とする塩基配列に対応するモジュールを単純につなぎ合わせるだけで作製できるため，一般的な分子生物学の設備や機器があれば，研究室内での作製が可能なゲノム編集ツールである．これまでに数多くの作製法が報告されているが，なかでも Addgeneから入手できる“ Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit”は最も手軽に導入可能なキットであり，世界中で広く利用されている．筆者らは上記のキットに改変を加えることで，さらに効率的に TALENを作製・評価するシステムを確立した．また，筆者らのシステムを用いて作製した TALENによって動物個体での遺伝子破壊が可能であることを示した．

海外注目論文解説　RNA誘導型ヌクレアーゼ：CRISPR/Casシステムによるゲノム編集佐久間　哲史 32巻5号 , 2013年4月 , pp.515-517

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2013年1月初頭，Science誌の早期オンライン版コンテンツであるScience Express に，CRISPR/Cas システムを用いた哺乳動物細胞におけるゲノム編集の論文が2 報掲載された1)，2) ．さらに同月，Nature Biotechnology 誌に3報3)〜5)，eLife誌に1報6) と立て続けに論文が発表され，CRISPRテクノロジーは瞬く間にゲノム編集研究の最前線に躍り出た．本稿を執筆している2013年2月現在では，遺伝子改変の効率や安全性（予期せぬ変異の導入の有無）に関する知見に乏しい状況ではあるが，ZFNやTALENに取って代わる可能性を秘めた技術であるだけに，本稿でいち早く情報をお伝えしたい．

人工エンドヌクレアーゼを利用した高等植物ゲノム改変技術の新展開刑部　敬史 , 刑部　祐里子 32巻5号 , 2013年4月 , pp.520-525

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従来の植物育種技術では，ゲノム上の遺伝子改変はランダムに起こる事象に頼っており，標的遺伝子を特異的に改変することは困難であった．近年，標的DNA配列特異的に切断可能な人工エンドヌクレアーゼが開発され，これによりゲノム上の標的遺伝子だけを改変する“ゲノム編集”技術が進展した．植物においてこのような標的遺伝子を特異的に改変する技術が確立すれば，植物育種の飛躍的な効率化が期待できる．本稿では筆者らが行った高等植物におけるゲノム編集の取り組みを概説し，今後の植物分子育種に果たす役割と展望を述べたい．

TALENを用いたヒトiPS細胞におけるゲノム編集李　紅梅 , Woltjen　Knut , 高橋　和利 , 山中　伸弥 , 堀田　秋津 32巻5号 , 2013年4月 , pp.526-531

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人工ヌクレアーゼを用いることで複雑なゲノムを自在に編集することが可能となってきた．シャーレ上で多彩な細胞へと分化可能なiPS細胞のゲノム編集ができれば，遺伝子ノックアウトの解析やレポーター細胞株作製による効率的な分化・初期化誘導など，非常に有用な研究ツールとなりうる．また，遺伝性疾患の原因遺伝子を高効率で修復可能となれば，患者由来のiPS細胞を用いた遺伝子治療がより現実味を帯びてくる．本稿ではデュシャンヌ型筋ジストロフィー患者由来のiPS細胞におけるTALENを用いた遺伝子修復の取り組みを紹介する．

ZFN/TALENとpiggyBacトランスポゾンを用いた高効率なヒトiPS細胞ゲノムの改変遊佐　宏介 32巻5号 , 2013年4月 , pp.532-537

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ヒトiPS細胞の1つの応用方法として自家移植による再生医療が挙げられるが，遺伝性疾患においては遺伝子変異の修復が必要である．治療にも使える修復法として，筆者らはZFNを使った高効率のジーンターゲティングと薬剤選択マーカー除去のためにシームレスに切り出すことのできるpiggyBacトランスポゾンを組み合わせ，α1アンチトリプシン欠損症患者由来iPS細胞において疾患原因である一塩基変異の修復を両アレル同時に行うことに成功した．さらにTALENの登場により，iPS細胞における遺伝子改変も次第に容易になってきている．これらの技術は再生医療だけでなく，in vitroでの病態解析への応用など今後さらに広がっていくだろう．

ゲノム編集技術を用いた遺伝子発現の定量的イメージング落合　博 , 柴田　達夫 , 山本　卓 32巻5号 , 2013年4月 , pp.538-542

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緑色蛍光タンパク質（GFP）のクローニングや蛍光顕微鏡性能の向上により，生きた細胞における蛍光タンパク質量や細胞内局在の動的変化を定量的に捉えることが可能となってきた．特に大腸菌や酵母などにおいては，内在遺伝子領域へレポーター遺伝子を挿入（ノックイン）することにより，生きた細胞における遺伝子発現の可視化および定量化が可能である．一方，多くの多細胞モデル生物ではノックインが利用できないため，その技術確立が求められていた．近年，人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術が理論上すべての生物で可能となり，今後多くの多細胞モデル生物において遺伝子発現の定量的イメージングが可能となることが期待される．本稿では，人工ヌクレアーゼZFNを利用した無脊椎動物のバフンウニでのノックインと，それによって可能となったウニ初期発生過程における遺伝子発現の定量的イメージングについて紹介する．

ZFN/TALENを用いたコオロギの遺伝子ノックアウト渡辺　崇人 , 三戸　太郎 , 野地　澄晴 32巻5号 , 2013年4月 , pp.543-549

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フタホシコオロギは，発生・再生研究における新たなモデル昆虫として注目されている．コオロギではRNAiやトランスジェニック技術が利用可能であるが，ノックアウトやノックインの技術は導入されていない．そこで筆者らは人工ヌクレアーゼに着目し，コオロギにおいて標的遺伝子のノックアウトに成功したので紹介する．さらにSURVEYORヌクレアーゼを用いて表現型非依存的に変異体を選別する方法を構築したが，この方法はその他の生物でも有効な手法であると考えられる．

脊索動物ホヤにおけるゲノム改変技術河合　成道 , Treen　Nicholas , 佐々木　陽香 , 笹倉　靖徳 32巻5号 , 2013年4月 , pp.553-557

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ホヤの一種カタユウレイボヤは室内飼育系が確立しており，遺伝学的な解析が可能な海産脊索動物である．カタユウレイボヤではトランスポゾンを用いたゲノム改変技術が可能であり，外来遺伝子をゲノムに導入したトランスジェニック系統，エンハンサートラップ系統，挿入突然変異体系統が作製され，遺伝子機能解明に利用されている．また，人工ヌクレアーゼを用いたゲノム改変も試みられており，ZFNがホヤゲノムに高い効率で変異を導入できることも示されている．本稿ではこれらに代表されるカタユウレイボヤのゲノム改変技術について最近の知見を紹介する．

TALENによる遺伝子改変ゼブラフィッシュの作製川原　敦雄 , 岡田　康志 32巻5号 , 2013年4月 , pp.558-563

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マウスでのES細胞の樹立は未熟な幹細胞がどのように機能的に特殊化された細胞へと発生・分化するかを調べるマテリアルを提供するとともに，ES細胞において目的の遺伝子を人為的に編集することを基盤とする遺伝子改変マウスの作製を可能とした．しかし，これまで他のモデル生物のES細胞樹立が成功していなかったことが生物種を超えた分子機能の解析を妨げている．ZFNやTALENといった人工ヌクレアーゼは，種を問わず幹細胞や受精卵のゲノムを直接編集する技術として大変注目されている．本稿では，遺伝学的な解析に適するモデル脊椎動物であるゼブラフィッシュに焦点を絞り，現在爆発的に技術革新が進むゲノム編集技術の開発状況を解説する．

ラットにおける遺伝子改変技術の新展開真下　知士 , 金子　武人 32巻5号 , 2013年4月 , pp.564-569

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ポストゲノム時代において遺伝子を自由に破壊・挿入・改変することができる「ゲノム編集」技術が注目されている．実験用ラットにおいてはZFNあるいはTALENを利用することで，遺伝子改変ラット（ヒト疾患モデル）を自由に作製できるようになった．これらのゲノム編集技術は短期間（約4〜 6カ月）かつ低コストであらゆる系統において遺伝子改変ができる優れた技術で，マウス，ラットだけではなくウサギ，ブタ，サルなどの中大動物にも利用されている．筆者らはエキソヌクレアーゼ（Exo1）とTALENをラット受精卵に共導入することにより，より効率的な遺伝子改変ラットの作製技術を開発した．

せるてく・あらかると

出会いと融合から生まれる新展開押村　光雄 32巻5号 , 2013年4月 , pp.518-519

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ショウジョウバエのだ腺染色体の核型進化を用いた「ショウジョウバエの亜種の進化」が大学学部の卒業研究であった．もちろん卒研であるから，教授の研究のお手伝いをしたにすぎない．確かに核型進化をトレースすることによって進化のプロセスを知ることができることは理解できたが，染色体の構造の変化が進化の原動力になるのか，単なる結果なのか，知りたいことがわからないフラストレーションを感じたのを思い出す．このフラストレーションこそがサイエンスの始まりであることをのちに知ることとなった．その後，本格的に研究生活に入ることになったが，12年間はひたすらヒトやマウス染色体の解析を行った．イヌの陰部がんの染色体解析，ヒト人工流産胎児の染色体解析，マウスX染色体の不活性化，マウス染色体転座の減数分裂時の分配法則の解明，レムール（キツネザルの属名）やエゾヤチネズミの染色体解析，ヒト白血病の染色体異常の解析などである．それぞれの染色体解析からそれなりの知見は得られてきた．例えば，種々の白血病型には特有の染色体転座が存在するなどで，私たちが発見した転座のいくつかは後にオンコジーンとの関わりが明らかになったし，現在ではその転座が診断にも役立っている．しかし，それまでの研究方法はそこにあるものを解析するだけで，実験的でない点にフラストレーションを感じ始めていた．

花に擬態したコオロギを創りたい野地　澄晴 32巻5号 , 2013年4月 , pp.550-552

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昆虫や魚などが花，葉，海藻などに姿形を似せて天敵から逃れたり，逆に餌をおびき寄せたりする現象は擬態と呼ばれ，誰しもどこかでお目にかかったことがあるであろう．それにしても見事なまでに擬態した昆虫などの写真を見るたびにどのようにしてそれが可能なのか？という素朴な疑問をいつも持ち，早くそのメカニズムを解明したいと思ってきた．多くの擬態した生物は，その形態などが遺伝するので，どのように擬態するかはゲノム情報に書き込まれているはずである．擬態していない生物のゲノム情報が，進化の過程で変化して擬態したことは間違いのないことであろう．多様な生物の中から自然淘汰というメカニズムだけで果たして，擬態した生物は誕生するのであろうか？といつも単純に思い，何かまだ知られていないメカニズムがあるのかもしれないと勝手に空想している．しかし，一般的には，我々の想像を絶する長い長い時間の中で，ほんの少しのゲノムの変化の積み重ねにより，現在の生物に進化してきたと考えるのが妥当で，決して擬態だけが特別ではないのであろう．いずれにしてもゲノムのどのような変化が擬態と関係しているかを調べればヒントは得られる．最近のシークエンサーの革命的進歩によりゲノム配列の比較が可能となり，擬態した昆虫についてもゲノムの比較データが数年以内に得られるであろう．実際，擬態した蝶についてはかなりの情報が得られてきている．擬態した蝶の翅の模様を作り出す遺伝子領域が同定され，スーパー遺伝子座と呼ばれている領域（遺伝子組換えの頻度が少なく，遺伝子群がまとまって次世代に伝えられる染色体領域）に存在していたことなどが報告されている．したがって，ダイナミックなゲノムの変化による既存の形態形成に関与する遺伝子の組み合わせの変化が擬態に関与していることは間違いないであろう．それでは，そのような変化を人工的に発生させ，長い間かかって生じたゲノムの変化を実験的に再現できないであろうか？擬態のメカニズムを解明するためには，ゲノムのダイナミックな人工的な編集技術の開発が不可欠である．もちろん擬態だけでなくすべての生命の研究に関係する．その意味で，本特集のゲノム編集技術は今後の生命科学の発展を左右する重要な技術であり，さらに飛躍的に発展させなければならない．いずれはヒト疾患の治療に応用されるであろうが，意外に早いかもしれない．

遺伝子組換え技術を一過的に活用して育成した生物の取り扱い鎌田　博 32巻5号 , 2013年4月 , pp.570-571

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私がこの原稿を書く羽目になったのはこれまでの度重なる偶然に起因する．1980年代初めから遺伝子組換え生物の取り扱いに関する様々な規則作りに偶然関わり続けてきたのだが（正確には関わらざるをえなかった），2010年12月のある日農林水産省内で開催されたEUの研究者との遺伝子組換え技術の社会的利用に関する意見交換会に呼ばれた．その会の最後，EUでは2007年から新しい遺伝子操作技術に基づく植物育種（New Plant Breeding Techniques；通称，その頭文字をとって『NBT』と呼ばれている）について検討しているが，日本ではどんな検討が行われているかと聞かれ，農林水産省の行政担当官・研究者が多数参加していたが，たまたま参加していた私が意見を求められた．遺伝子組換え植物を台木とし，既存の非遺伝子組換え有用品種を穂木として栽培する事例について，カルタヘナ法や遺伝子組換え食品としての安全性確保の観点から回答したが，このことがきっかけで翌年2011年秋スペインで行われたNBTに関する国際ワークショップに招聘されることになってしまった．

基本情報

細胞工学
32巻5号
(2013年4月発行)

電子版ISSN：印刷版ISSN：0287-3796 Gakken

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