細胞工学 30巻8号 (2011年7月発行)

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特集　次世代シークエンサーを使いこなす:目的別解析法からデータ処理まで

特集を読むまえに　基礎の基礎清水　厚志 , 佐々木　貴史 30巻8号 , 2011年7月 , pp.790-795

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次世代シークエンサーが登場して6年目となり，ほとんどの研究者が名前を知る解析装置となった．しかし，具体的にどのような解析が可能で，どのようなサンプルが必要とされるのかを把握している人は多くはない．旧来のシークエンサーと比べて1ランあたりのコストが高く，サンプル調製の行程は複雑で，さらにデータ解析にはインフォマティクスの知識が必要であるなど，運用時には多くの準備を必要とする機器ではあるが，その大量出力を生かした解析手法は，DNAシークエンス解読のみに留まらず，多くの生化学的な解析にも応用されている．これまでは大きなシークエンシングセンター以外では使う機会が稀であったが，2010年から小型次世代シークエンサーや導入が容易な解析用ソフトも次々と登場し，いよいよ研究室単位で次世代シークエンシングから解析までを進められる環境が整いつつある．そこで，本特集ではこれから次世代シークエンサーを使ってみたいと考えている初学者の方を対象に，具体的な手法について紹介したい（図1）．ここでは各論に入る前に次世代シークエンサーの歴史を振り返りながら各解析手法について概説したい．

マルチプレックス法によるバクテリアゲノムのde novo DNA配列解読佐々木　貴史 30巻8号 , 2011年7月 , pp.796-800

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次世代DNAシークエンサー（NGS）の技術開発により，1解析あたり600Gb以上という超大量のDNA配列を得ることができるようになった．今後もアウトプットは増加し，バクテリアゲノムも代表的な株だけでなく，株ごとの解読も行われると考えられる．そこで，データ量の多いショートリードNGSでのマルチプレックス法を用いて複数のバクテリアゲノムのde novo DNA配列解読の結果，リピート配列以外の領域をほぼ解読することができた．本稿では，マルチプレックス法での解析の流れと，de novo DNA配列解読でのアセンブラや冗長度の条件などについて紹介する．

動物ゲノム解読と比較ゲノム解析　脊椎動物のde novo assembly、メダカ近交系全ゲノム解析水口　洋平 , 豊田　敦 30巻8号 , 2011年7月 , pp.801-805

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次世代シークエンサー（NGS）の性能は年々向上しており，近年では脊椎動物ゲノムのde novo assemblyにも利用され始めている．一方，NGSが生成するショートリードに特化したアセンブラの開発も精力的に進められており，NGSのみを使用して従来のサンガー法によるアセンブリ結果に近い高精度な配列決定を行ったという報告もある．本稿では脊椎動物のゲノムを対象としたde novo assemblyの現状と解析手法について紹介したのち，当研究室で進めているメダカ近交系の比較ゲノム解析およびNGSを利用したドラフトゲノム配列の精度向上について紹介する．

Cell Tech Eye　次世代シークエンサーを用いた疾患原因遺伝子の探索　倫理的な配慮も含めて小崎　健次郎 , 工藤　純 30巻8号 , 2011年7月 , pp.806-807

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原因遺伝子がいまだ不明である遺伝性疾患の研究を進めるために，次世代シークエンサー（next generation sequencer；NGS）により疾患の原因を明らかにしようとする研究が国内外で展開され，すでに成果が出始めている．我々，慶應義塾大学医学部でも疾患原因遺伝子の解明を目的としたNGSの運用体制を整えてきた．本稿では，医学部においてNGSを用いた網羅的なゲノム解析により，疾患原因遺伝子の探索を実施する際に特に重要と思われる3つの点について，我々の経験に基づき紹介する．

ヒト･マウスの全エキソンリシークエンシングと疾患原因遺伝子の同定清水　厚志 30巻8号 , 2011年7月 , pp.808-814

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疾患原因遺伝子の同定には連鎖解析と候補遺伝子ごとのシークエンシングが必要であったが，次世代シークエンサー（NGS）とエキソンキャプチャーキットの登場により，安価に全エキソンから候補遺伝子を抽出することが可能となった．また， 1,000人ゲノム計画により膨大な個人ゲノム配列と多型データを解析に利用することも可能となり，同時に我々が50〜 100程度の遺伝性疾患の保因者であることも判明した．本稿では，これらのデータベースや解析プログラムを利用したリシークエンシング，特にヒト，モデル生物の全エキソンリシークエンシング（エキソーム解析）の結果から疾患原因遺伝子を同定する方法について概説する．

Cell Tech Eye　日本人ゲノム参照配列とバリエーションデータベースの必要性辻　省次 30巻8号 , 2011年7月 , pp.815-816

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次世代シークエンサー（next generation sequencer；NGS）の技術革新には目を見張るものがある．現在市販されている最新のNGSを用いれば，1週間あまりで，5,000億塩基対（500Gb）程度のゲノム配列情報を取得することができる．NGSから得られるデータは，75〜100塩基程度のショートリードが膨大な数が得られることが特徴である．ゲノム医学研究においては，これらの膨大な情報から高精度にゲノム配列の変化を検出することが重要で，ゲノムバイオインフォマティクスの果たす役割が飛躍的に大きくなってきている．また，NGSから得られるデータについては，一定の割合でエラーを伴うことが課題であったが，最近は精度の点でも改善されてきており，エラーに対する配慮は必要であるものの，医学研究に応用することが十分可能なレベルに到達している．

トランスクリプトーム解析鈴木　穣 30巻8号 , 2011年7月 , pp.817-822

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次世代シークエンサー（NGS）を用いて大量の塩基配列を決定することが可能になった．NGSは，DNAの配列自体を決定するのに用いるのはもちろんだが，試料調製を工夫することによって，遺伝子発現量の計測あるいはその制御に関わる因子を解析するのに用いることもできる．例えば，真核生物の細胞には，1細胞あたり50〜 100万個程度のmRNAが含まれると考えられているが，これらの配列をすべて決定することができれば，その数を数えることでどの遺伝子が何分子mRNAとして発現していたかを解析することができる．また，miRNAなど塩基長の短いRNA配列，キャップ構造などの特徴的な構造物の近傍に存在するRNA配列，あるいは，核，細胞質，ポリソームといった特定の細胞内画分にあるすべてのRNA配列を同定することで，様々な局面でRNAの動態を計測することができる．さらに，ChIP Seqと類似した方法をRNA結合タンパク質に用いれば，そのタンパク質がどのようなRNAと結合していたのかを解析することも可能である．塩基配列を決定するのが“シークエンサー”であるが，本稿では，その“塩基配列の決定”以外の用い方，特にmRNA発現量の測定（RNAタグのデジタル計測）といった，いわゆるトランスクリプトーム解析への応用について概説する．

網羅的クロマチン機能解析油谷　浩幸 30巻8号 , 2011年7月 , pp.823-829

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染色体にコードされた情報の読み出しの制御については，特定の配列に結合する転写因子をはじめとするDNA結合タンパク質を中心に精力的に研究されてきた．転写開始点やエンハンサー領域など遺伝子発現制御に関わる領域はヌクレオソームフリーであることが多い．一方，異なる系譜の細胞ごとに利用される染色体領域は異なっているほか，染色体複製や修復のプロセスにもDNAメチル化やヒストンの化学修飾による標識が関与している．シークエンス技術の進歩により，クロマチンの機能解析への応用が進んでいる．本稿では，クロマチン免疫沈降によるヒストン修飾や転写因子結合領域の同定に加え，三次元的クロマチン相互作用の検出，オープンクロマチン領域同定法について紹介する．

DNAメチル化解析鈴木　雅子 , Greally　John M. 30巻8号 , 2011年7月 , pp.830-834

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近年，次世代シークエンサー（NGS）を用いた全ゲノム関連解析（whole genome association study；WGAS）が複雑な細胞機能や疾患メカニズムを解析するうえで脚光を浴びている．WGASでは，限られた領域のみではなく，ゲノム全体を解析することで従来の手法では難しかった新しいアイデアに基づく解析を可能にする．本稿では，そうしたWGASの中でエピジェネティック修飾の解析，特にDNAメチル化解析技術を概観するとともに，筆者らが開発をした比較的安価で，かつ定量性の高い方法を紹介する．

iPS細胞におけるレトロウイルス挿入部位の網羅的同定法山本　拓也 30巻8号 , 2011年7月 , pp.835-840

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レトロウイルスベクターによる外来遺伝子の導入は，長期的かつ安定的な遺伝子発現を達成することが可能であり，遺伝子の機能解析などの基礎研究から遺伝子治療といった応用研究まで幅広く利用されている．しかしながら，本手法は宿主細胞のゲノムに外来遺伝子を組み込むため，組み込まれた場所によっては細胞機能に大きな影響を及ぼす場合がある．したがって，レトロウイルスベクターによる外来遺伝子のゲノムへの挿入箇所を同定することは，導入細胞の機能解析を行ううえでも，導入細胞の安全性評価などの品質管理を行ううえでもきわめて重要である．本稿では，次世代シークエンサー（NGS）を利用した外来遺伝子挿入部位の網羅的同定法について，レトロウイルスベクターによって樹立されたiPS細胞を例として紹介する．

DDBJ Cloud　次世代シークエンサーの配列アーカイブとクラウド型解析ツール神沼　英里 , 中村　保一 30巻8号 , 2011年7月 , pp.841-846

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日本DNAデータバンク（DDBJ）では，DDBJ Cloudと呼ぶ大量塩基配列を扱うためのクラウド環境の整備を進めており，次世代シークエンサー出力配列のアーカイブデータベースDRA（DDBJ Sequence Read Archive）と解析ツールDDBJPipelineを提供している．本稿では，DRAやDDBJ Pipelineの説明とともに，研究者が利用可能なクラウドを基盤とする次世代シークエンサーの解析ツールについて紹介する．また，DRAの公開データの統計から次世代シークエンサーの利用動向について紹介するとともに，DRAへの登録方法とヒトゲノム個人データを登録するときの制限条件について述べる．

連載　HOT PRESS

DNA複製と細胞極性をつなぐ経路　癌細胞の異常な形を理解するヒント! 久米　一規 , 平田　大 30巻8号 , 2011年7月 , pp.854-855

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癌細胞では，異常な増殖とともに，その形も異常になることが知られているが，その詳細は不明な点が多い．チェックポイント機構は，細胞に異常が生じた際，その異常を解消するまで自身の増殖を停止させる，生命維持に必須な機構であり，本機構の破綻は細胞癌化の一要因である．一方，細胞極性は，細胞自身の機能発現に必須であり，細胞増殖や分化と連動し適切に制御されるが，その連携制御機構は不明な点が多い．筆者らは，従来，単細胞モデル生物・分裂酵母を使って細胞周期と細胞極性との連携制御機構を解析してきたが，今回，DNA複製チェックポイント機構が細胞周期のみならず細胞極性をも制御することを見いだした．本経路の発見は，癌細胞の異常な形を理解するためのヒントになるのではないかと考えている．

基本情報

細胞工学
30巻8号
(2011年7月発行)

電子版ISSN：印刷版ISSN：0287-3796 Gakken

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