アルカリホスファターゼの化学発光基質AMPPD

　臨床検査に用いられるアルカリホスファターゼの基質としては，従来より比色測定用のp-ニトロフェニルリン酸（PNP）が知られている．また，高感度基質としては4-メチルウンベリフェリルリン酸（4MUP）が一般的である．これらは臨床検査の分野では生化学のみならず，免疫血清でのEIAの標識酵素であるアルカリホスファターゼの基質として利用されている．一方，EIAにおける迅速，高感度化にともない，化学発光あるいは生物発光法が注目されている．本稿では，最近報告されたアルカリホスファターゼの新規な化学発光基質（AMPPD）の反応原理，その特徴，応用について述べる．

　1988年，米国のDr．Bronsteinらは，アルカリホスファターゼの安定な化学発光基質3-（2'-spiroadamantane）4-methoxy－4-（3"-phosphoryloxy）phenyl－1,2-dioxetane（AMPPD）を合成した^1）．その構造は図1の（Ⅰ）に示すように，ジオキセタンに結合するフェニルリン酸とジオキセタン骨格を立体的に安定化させるアダマンチル基よりなる．このAMPPDは酵素により加水分解されて，比較的不安定な中間体（Ⅱ）となる．この化合物はアルカリ溶液中でジオキセタン骨格が開裂して，1重項励起状態のm-ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（Ⅲ）とアダマンタノンになる．この励起化合物（Ⅲ）は波長470nmの光を発して基底状態に戻る．この反応は酵素で励起化合物の生成をくり返すため，酵素反応時間20分～30分で発光量がプラトーになる増幅型となっている．アルカリホスファターゼのこの基質に対するKm値は2×10-4mol/lであってPNPや4MUPと類似しており，基質の親和性にアダマンチル基は影響していない．