GHRHの超高感度測定法の開発と臨床的意義

Development and clinical application of an ultrasensitive immune complex transfer-EIA for human growth hormone（GH）-releasing hormone（GHRH）

　ヒト成長ホルモン（GH）分泌促進ホルモン（GHRH）はアミノ酸残基44個からなる視床下部ホルモンで，下垂体のGHの合成ならびに分泌を促進する。その末梢血中濃度は従来のラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay：RIA）では測定感度が不十分で，血液から抽出・濃縮して測定する必要があった。筆者らはS/N比を飛躍的に増大させる免疫複合体転移EIA法（immune complex transfer EIA：ICT-EIA）という新規の測定原理をヒトGHRHに応用したところ，従来法と比較し1,000倍以上の高感度化に成功し，ゼプトモル（zmol=1×10^-21mol）レベルの測定が可能となり（400 zmol/assay，0.2pg/ml），末梢血中のGHRH濃度を無抽出・直接的に測定した（健常者：4-14pg/ml）。GHRHトランスジェニックラットを作出し，GHRHのautocrine・paracrine・endocrine機構を介するGH産生下垂体腺腫の発生と，血中のヒトGHRH・ラットGH分泌動態との経時的相関を明らかにした。さらに，本邦における異所性GHRH産生腫瘍による先端巨大症の発症頻度（先端巨大症全体の0.3％）と病態を解明した。

はじめに

　GHRHは下垂体のGHの合成ならびに分泌を促進する視床下部ホルモンで（図1），ヒトではアミノ酸残基44個からなり，1-29位のN端側から中間部がその生物作用に必須である。種属差は主に，C端側30-44位に存在する（表1）。構造上，セクレチン，グルカゴン，バソアクティブインテスティナルポリペプチド（VIP），ペプチドヒスチジンイソロイシン（PHI），ヒトではペプチドヒスチジンメチオニン（PHM），下垂体アデニルシルラーゼ活性化ペプチド（PACAP）などの脳腸管ペプチドの1つで，セクレチンファミリーに属する。従来の視床下部ペプチドの単離とは異なり，1982年，先端肥大症を呈した異所性ヒトGHRH産生の膵腫瘍組織抽出物より単離・同定された^{1, 2）}。GH分泌抑制性のソマトスタチン（SRIF）^3）と協調して，下垂体成長ホルモン（GH）分泌を調節する。

　視床下部の正中隆起部から下垂体門脈血中に放出されるGHRHは，血流を介して，瞬時に下垂体GH細胞に到達し，細胞表面に存在する特異的GHRHレセプターに結合する。さらに細胞膜の促進性GTP結合調節蛋白質（Gs）を刺激し，アデニルシクラーゼを活性化することにより，セコンドメッセンジャーである細胞内のc'AMPを増加させる。細胞内c'AMP濃度の上昇は蛋白質リン酸化酵素（PKA）を活性化し，（1）秒・分単位ではCaイオンの流入を介する分泌促進作用，（2）時間・日単位ではGHの合成促進作用，（3）月・年単位ではGH細胞分化・増殖促進作用を生ずる^4）。ヒトGHRHは血中では比較的速やかに生物活性のないヒトGHRH（3-44）NH₂に分解され，その生物学的半減期は約7分である^5）。その末梢血中濃度は数フェムトモル（femtomole，fmol＝1×10^-15mol）/mL以下で，従来のラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay：RIA）では測定感度が不十分で，血液から抽出・濃縮して測定する必要があった。筆者らは，RIAと比較して約1,000倍以上の，感度と特異性に優れた新規のEIA法の原理^6）をヒトGHRHに応用し，GHRHの超高感度測定法を開発した^7,8）。同法を用いて血中ヒトGHRHを無抽出・直接的に測定し，その臨床的意義を検討した。

　Human growth hormone-releasing hormone（hGHRH）, originally isolated from pancreatic tumor that caused acromegaly, is a hypothalamic peptide consisting of 44 amino acid residues that stimulates both synthesis and release of growth hormone. HGHRH in plasma has been measured by radioimmunoassay after extraction with Sep-Pak cartridges or by immunoaffinity. The extraction methods are not only time-consuming but also cause great variation in assay results. We have developed a novel and ultrasensitive immune complex（antibody-antigen-antibody complex）transfer-enzyme immunoassay（ICT-EIA）that enables us to measure concentrations of human GHRH in plasma directly. The detection limits of the ICT-EIA is 400 zeptomole（zmol＝1×10^-21mol）/tube or 0.2pg/ml, which is 1,000 times more sensitive than those of conventional RIAs and far below the normal range of plasma GHRH levels in normal human subjects（4-14pg/ml）. The ICT-EIA for hGHRH provides us an opportunity to elucidate the autocrine, paracrine and endocrine mechanisms by which GHRH develops GH-producing pituitary adenoma in hGHRH-transgenic rats in a time-dependent manner. When we screened a series of 300 patients with acromegaly with the hGHRH ICT-EIA, we found one patient with a GHRH-producing carcinoid tumor of the pancreas（incidence of acromegaly due to ectopic GHRH source is 0.3％）. Using the ICT-EIA, we also found several unique natures of acromegalic patients with ectopic GHRH-producing tumors.