トロポニンTの測定法

　筋原線維は筋肉細胞の最小単位で，ミオシン分子で構成されるものと，アクチン，トロポミオシンなどから構成される物がある．この両者の架橋の役割と細胞内Caによる筋収縮の調節をする働きを持っているのがトロポニンT （TnT）複合体である．この複合体はトロポニンI,C,T （TnI，TnC）で構成され，まったく異なる機能を持っている．総TnTの94％は細胞内で不溶性で，6％がサイトゾール中で可溶性で，その85％が遊離する．ミオシン軽鎖も不溶性で，筋膜損傷時にサイトゾールミオシン軽鎖－1の28％，総ミオシン軽鎖としては0.035％ぐらいしか遊離しない．CKはサイトゾール中に存在し，細胞外膜損傷を知るのによく，また，ミオシン軽鎖は細胞全体の壊死を知るのによい指標である．両者は心筋には特異性がないが，TnTはサイトゾール可溶性の性質と不溶性構造分子の性質を持ち，かつ心筋と骨格筋とはアミノ酸構造が異なる．筋肉疾患マーカー蛋白として，心筋と骨格筋の鑑別に，これを測定することは心疾患の診断に有用である．測定原理は心筋と骨格筋のTnTのアミノ酸配列の違いをビオチン標識したポリクローナル抗体とペルオキシダーゼ（POD）標識したモノクローナル抗体を用いて心筋特異性のあるTnTをワンステップサンドイッチ法を用いチューブ固相法で測定する．心筋由来のTnTに対するポリクローナル抗体はヤギ血清から得て,これにビオチンを結合し,アビジンを固相化した(14ng/tube)ポリビニールクロライド性のチューブ内で反応を行う.ストレプトアビジンービオチン結合は親和性が高く,液相で抗原抗体反応が行われると迅速で高感度の測定ができる.ポリクローナル抗体はわずかではあるがミオシン軽鎖と反応する.モノクローナル抗体は細胞融合法により,ハイブリドーマのセルライン1B10-lgG抗体にPODを標識(40　mU/ml)して,心筋特異性の高いTnTのエピトープを認識する.この2つの抗体と結合したTnTを標識酵素であるPODがABTSと過酸化水素を基質として発色定量する.測定は①検体またはカリブレータ100μlをストレプトアビジンを固相化した測定用チューブに加えてビオチン標識のポリクローナル抗体と同時にモノクローナル抗体をクエン酸(10mmol/l)・リン酸(47　mmol/l)緩衝液(pH6.3)に溶解したものを100μ1加える.ストレプトアビジンーピオチン結合抗体とTnTと反応し,さらにこの複合体にモノクローナル抗体と25℃,1時間反応させる.②TnTと結合していない抗体および検体(血清)成分を洗浄除去する.③基質色原体溶液[リン酸一クエン酸緩衝液(pH7.4)に過酸化水素(3.2mmol/l)とABTS(1,9mmol/l)]1mlを加え,PODと25℃で30分間反応させて405　nmで測定する.測定レンジは0.10～25ng/mlで0.5ng/ml以下ではやや正確性に欠ける.5%BSAを添加するとやや高めの非特異結合を示す.カットオフ値を0.25ng/mlとして測定する.日内再現性はCVとして1.5～5.5%,日差再現性は1.6～10.7ぐらいである.本法はヒト骨格筋とは1%ぐらい交差反応し,ヒトとウシ心筋とは100%近くクロスし,ウシ心筋TnTはカリブレーターとして使える.添加回収試験は平均99%である.参考値は全体で0.05±0.06(n=170),男0.06±0.07(n=79),女0.03±0.04ng/ml(n=97)である.血清での測定値に比べてEDTA,シュウ酸では正の,ヘパリン,クエン酸では負誤差が認められ,血清を用いたほうが安定している.溶血,高ビリルビン血症や高脂質血症などでの影響は顕著でない.高リウマチ因子血症では高値となり注意が必要である.心筋梗塞や心臓手術で高値を示し,検出時間が長く,診断的特異性が高い.不安定狭心症の40%ぐらいに正常値の2～3倍の高値を示す.骨格筋障害の95%では正常である.肺癌や食道癌でも異常高値を示す例がある.心筋梗塞でのPTCAやPTCRによる治療効果の判定や経過観察にも有効と考えられる(なお,この方法はベーリンガーマンハイム社でキット化されている).